Modulación de la inmunidad nutricional como estrategia de resistencia de salmones a la infección con Piscirickettsia salmonis

En Chile, el Síndrome Rickettsial del Salmón (SRS) es la enfermedad infecciosa que causa mayores pérdidas económicas en la salmonicultura, transformándose en un peligro para la sustentabilidad de la industria, estimándose pérdidas y gastos para su control de alrededor de US$700 millones anuales. Hasta ahora, los enfoques profilácticos y preventivos que se han probado para combatir SRS han sido insuficientes, por lo que el control de SRS se ha realizado principalmente con estrategias de tratamiento farmacológico basado en el uso de antibióticos. En Chile, se utilizan alrededor de 700 veces más antibióticos que en Noruega para obtener cantidades similares de salmónidos, situación que ha generado fuertes críticas a la industria chilena y los consiguientes perjuicios comerciales. Adicionalmente, esta estrategia orientada al uso de fármacos antimicrobianos dirigidos al patógeno (Pathogen-directed therapy,”PDT”), ha desencadenado una grave desventaja: el desarrollo de la resistencia microbiana a los antibióticos y resurgimiento de enfermedades infecciosas. En respuesta a esto, un prometedor enfoque terapéutico propone perturbar las vías metabólicas moleculares utilizadas por los patógenos intracelulares en los hospederos, mediante el uso de fármacos antimicrobianos dirigidos al huésped (Host-directed therapy, “HDT”). Esta estrategia, al reducir la presión selectiva sobre el patógeno, además de prevenir y/o tratar las infecciones disminuye la probabilidad de desarrollo de resistencia microbiana a los antibióticos convencionales. Para abordar la identificación de estas funciones biológicas en salmones, nosotros identificamos mediante estudios de genómica funcional, grupos de procesos biológicos activamente regulados en respuesta a la infección, algunos de ellos específicos de familias resistentes. Entre estos procesos destacó la regulación del metabolismo de hierro, que mediante un proceso de inmunidad nutricional fue capaz de limitar de manera fisiológica la disponibilidad del metal a Piscirickettsia salmonis, evitando así la proliferación bacteriana. Con esta información, en el contexto del Proyecto “Modulación de la inmunidad nutricional como estrategia de resistencia de salmones a la infección con Piscirickettsia salmonis” del Programa para la Gestión Sanitaria en la Acuicultura (PGSA)- Sernapesca, propusimos usar un quelante de hierro oral (deferiprona, “DFP”) para evitar la proliferación bacteriana y el desarrollo de la SRS mediante una estrategia farmacológica no antibiótica entregada a través de la dieta de los peces. Para esto, se propusieron cuatro objetivos principales: 1) Analizar la de aceptabilidad, toxicidad y biodisponibilidad de las dietas experimentales en salmónidos; 2) Caracterizar las dietas experimentales de mejor aceptabilidad y biodisponibilidad en salmónidos; 3) Determinar la efectividad de las dietas sobre la mortalidad de salmónidos infectados experimentalmente con Piscirickettsia salmonis y 4) Caracterizar aspectos moleculares, fisiológicos y productivos de los salmónidos sometidos a las diferentes condiciones experimentales (dietas/infección).

Análisis de la aceptabilidad, toxicidad y biodisponibilidad de las dietas experimentales y caracterización de las dietas experimentales de mejor aceptabilidad y biodisponibilidad en salmónidos.

Para alcanzar estos objetivos, se seleccionaron cuatro concentraciones de deferiprona, que de acuerdo al estado del arte publicado, no son tóxicas para humanos: 100; 50, 10 y 0 mg de quelante/Kg pez/día, las cuales fueron utilizadas para generar dietas para salmónidos (pellets). Cada dieta experimental y control (0 mg de quelante/Kg pez/día) se generó en una versión encapsulada (E) y otra no encapsulada (NE), ninguna de las cuales presentó diferencias micro o macro estructurales.

Con cada una de estas dietas, se realizó un estudio de aceptabilidad, toxicidad y efecto sobre el contenido de hierro en salmones. Para esto, se evalúo el consumo de las dietas durante 30 días de alimentación sin observarse diferencias cualitativas en la aceptación de las dietas (no hubo regurgitación de los pellets), ni diferencias cuantitivas entre alguna condición experimental. Adicionalmente, para evaluar la potencial toxicidad del quelante, se evaluó también la mortalidad de los peces, sin observarse efectos en la sobrevida. Los análisis de necropsia tampoco evidenciaron lesiones macroscópicas que hicieran sospechar que la administración del quelante en la dieta generan efectos tóxicos en los individuos. Así entonces, tanto los individuos tratados como los controles se encontraron clínicamente sanos, lo que indicó que el quelante en las concentraciones suplementadas y en los formatos de entrega (tres dosis diarias, encapsuladas y no encapsuladas) no son tóxicas y serían seguras como estrategia de entrega a través de la dieta. Para determinar el efecto de las dietas sobre el contenido de hierro en los peces, se midió el contenido del metal mediante espectroscopia de fluorescencia de rayos-X por reflexión total (TXRF). Los resultados indicaron que la dieta que contiene 100 mg de DFP/Kg/día produjo una disminución estadísticamente significativa del metal en riñón, bazo y corazón, sin diferencias significativas entre las versiones encapsuladas (EN) y no encapsuladas (NE), sugiriendo que la biodisponibilidad del quelante es adecuada en peces y que no requiere ser encapsulada para mejorar su biodisponibilidad ni efecto farmacológico. Aunque no se observaron diferencias significativas en el contenido promedio de hierro con las dietas suplementadas con menos de 100 mg de DFP/Kg/día, probablemente debido a la variabilidad biológica y al número de peces utilizados, la dieta con 50 mg de DFP/Kg/día mostró contenido de hierro menores que la dieta control, por lo que se consideró evaluarla en los desafíos futuros de peces desafiados con Piscirickettsia salmonis.

Determinación de la efectividad de las dietas sobre la mortalidad de salmónidos infectados experimentalmente con Piscirickettsia salmonis

Para abordar el objetivo propuesto, se decidió utilizar tres dietas: dieta control (0 mg/Kg/día DFP), dieta 1 (50 mg/Kg/día DFP) y dieta 2 (100 mg/Kg/día DFP), todas no encapsuladas. Además, estas dietas se empezaron a suministrar antes o después del desafío con Piscirickettsia salmonis, generando las condiciones de protocolo preventivo (preventiva, pre-tratamiento o crónico) y protocolo de tratamiento (curativa, tratamiento o agudo), respectivamente. Las dietas medicadas y preventivas fueron suministradas 11 días antes del desafío y hasta el final de este (30 días post-infección) completando 41 días de alimentación con cada condición. Por otra parte, el protocolo de tratamiento consideró que las dietas fueran suministradas el día después del desafío y hasta el final de este, completando 29 días postinfección. Para cada condición experimental se evaluó el consumo diario de cada dieta sin encontrarse diferencias promedios en el consumo durante el ensayo completo, pero sí se observaron variaciones diarias oscilantes, las que siempre fueron completadas con dietas controles para evitar incorporar una nueva variable asociada a diferencias nutricionales oscilantes entre las condiciones (condiciones isoenergéticas). Esto nos permitió asegurar que la única variable entre las condiciones fue la concentración de quelante disponible.

Antes de comenzar a alimentar a los peces con las dietas medicadas y con el objetivo de determinar la capacidad patogénica del aislado a utilizar en el ensayo principal de infección, se realizó un ensayo de dosis letal 50 (DL50). El aislado de Piscirickettsia salmonis usado fue del genogrupo B (LF-89 like) y se llevó a cabo en las dependencias de la facility Aquadvise (Quillaipe-Puerto Montt, región de Los Lagos) bajo la supervisión del investigador principal y los postdoctorados del proyecto. El día 11 postinoculación comenzaron las mortalidades en el grupo de peces inoculados con la dosis bacteriana más alta y la progresión de la infección fue dosis dependiente. Dado esto, y con el objetivo de poder evaluar el efecto protector del quelante en el escenario más exigente posible, decidimos utilizar la concentración más alta evaluada del patógeno para el ensayo de desafío principal, mediante inyección intraperitoneal del patógeno en los peces (y no por cohabitación).

Los peces fueron trasladados a 24 estanques de 180 L con 70 peces cada uno, quedando separados físicamente los grupos desafiados (tratados_infección) de los no desafiados (controles_infección) en dos salas independientes. Los peces fueron distribuidos en los estanques asegurándose de que no existieran diferencias significativas en peso ni tamaño al momento de ser desafiados. Un grupo de estanques fue utilizado exclusivamente para seguir la mortalidad para los peces alimentados con las diferentes dietas (para no afectar las densidades ni estresar a los peces), mientras que otro grupos de estanques fue utilizado para tomar las muestras y hacer los análisisasociados a los futuros objetivos comprometidos. Se definieron 6 puntos de muestreo distribuidos a lo largo de la curva de supervivencia/mortalidad (tomando como referencia los resultados preliminares obtenidos en el DL50) para poder caracterizar la infección en la fase de latencia, exponencial y estacionaria. En cada proceso de muestreo, se tomaron al menos 5 peces por estanque tanto del grupo desafiado como no desafiado (60 peces por punto de muestreo) y a cada pez se le extrajo un total de 10 muestras: sangre (plasma y elementos figurados), hígado, bazo, corazón, riñón anterior, estómago, ciegos pilóricos, intestino y contenido intestinal, obteniéndose un total de 600 muestras por cada punto de muestreo. Al ser 6 puntos de muestreos durante la curva de mortalidad y 600 muestras por evento, se completaron alrededor de 3600 muestras, más aquellas asociadas a los puntos de caracterización inicial de la población de peces.

Al analizar el efecto de las dietas medicadas con DFP sobre la supervivencia de los peces frente al desafío y compararlo con la condición control (peces alimentados con dietas no medicadas), observamos que a tiempo final (30 dpi), todos los peces alimentados con las dietas medicadas presentaron un mayor porcentaje de supervivencia (menor mortalidad) que los peces alimentados con la dieta control. Los resultados indicaron que los porcentajes de mortalidad fueron: Dieta control 92,31%; Dieta 2 Tratamiento 86,15%; Dieta 2 preventiva 83,08%; Dieta 1 Tratamiento 81,5% y Dieta 1 preventiva 63,08%. Todas las dietas medicadas, excepto la dieta 2 preventiva, mostraron un nivel significativo de protección frente a la infección y consecuente mortalidad. Cabe destacar que en términos de supervivencia, el grupo de peces alimentados con dietas medicadas pero no desafiados no presentaron diferencias significativas en mortalidad en relación al control, permitiendo atribuir las mortalidades a la infección bacteriana y no a la adición de quelante en la dieta. Finalmente, al analizar la eficacia de las dietas en términos del porcentaje relativo de supervivencia 60 (RPS60), clásico índice utilizado en la evaluación de eficacia de vacunas en peces (comparación entre mortalidades cuando el control llega al 60% de mortalidad), observamos que la Dieta 1 preventiva presenta un RPS60 de 54%, lo que es considerado una muy alta eficacia de protección para un tratamiento dietario no antibiótico.

Caracterización de aspectos productivos, fisiológicos y moleculares de los salmónidos sometidos a las diferentes condiciones experimentales

Para caracterizar y comparar aspectos productivos, fisiológicos y moleculares entre los peces que fueron sometidos a las diferentes condiciones experimentales, se determinó tomar muestras en seis tiempos representativos de las diferentes etapas de la curva de mortalidad, M0: 0 dpi (justo antes de la inoculación bacteriana); M1: 4 dpi (fase lag 1); M2: 8 dpi (fase lag 2); M3: 16 dpi (fase exponencial); M4: 23 dpi (fase estacionaria 1) y M5: 30 dpi (fase estacionaria 2) en función de lo observado en las curvas de mortalidad obtenidas durante el LD50. Como parámetro productivo, se medió el peso de los peces al inicio y al final del ensayo para todas las condiciones. Los resultados indicaron que no hubo diferencias significativas entre los grupos experimentales al inicio del ensayo ni a los 11 días de entrega del quelante del tratamiento preventivo antes del desafío, pero sí diferencias marginales pero significativas entre los grupos tratados y controles al final del ensayo. Los peces alimentados con la dieta 1 (50 mg DFP /Kg/día) mostraron una disminución del peso promedio en un 7,7 % y un 5,2 % para los protocolos de entrega preventiva y curativa respectivamente, mientras que los peces alimentados con la dieta 2 (100 mg DFP/Kg/día) mostraron una disminución del peso promedio en un 12,7 % y un 55,4 % para los protocolos de entrega preventiva y curativa, respectivamente. Esta disminución muestra una tendencia dosis y tiempo dependiente, mostrando que las mayores concentraciones de quelante (dieta 2) administradas por más tiempo dan un mayor efecto sobre el peso de los peces. Estos resultados sugieren un rango de optimización potencial de las dosis y formatos de entrega de alimentos medicados para disminuir los efectos sobre la pérdida de peso. Adicionalmente, con el objetivo de caracterizar los aspectos que permitieran interpretar los resultados de protección de la dieta 1 preventiva, se midieron diferentes parámetros plasmáticos en los peces tratados y controles, los que se compararon entre M0 y M5. En general, los parámetros medidos no presentaron diferencias significativas en ninguno de los puntos muestreados o no lo hicieron de manera consistente entre losgrupos experimentales en el tiempo, enfatizando que a pesar de los efectos protectores que muestra el quelante frente a la SRS, no se alteran de manera evidente los aspectos fisiológicos en los peces. Interesantemente, una excepción a esta observación es el aumento en el contenido de hierro al final del ensayo (M5) en el grupo de peces tratados con la dieta 1 preventiva en la condición no infectados, el cual aumentó significativamente su abundancia en relación a los tiempos anteriores de muestreo. Estos resultados sugieren que los peces son capaces de activar mecanismos de absorción de metal al sensar un déficit producido por el quelante; sin embargo la presencia continua de DFP en la dieta correlaciona con la baja en el contenido del metal en los órganos medidos.

Finalmente, con el objetivo de determinar si la dieta que generó los mejores resultados de protección en el desafío de peces con Piscirickettsia salmonis correlacionaba con cambios de expresión génica de transcritos marcadores del estatus celular de hierro, se midió la abundancia relativa del receptor de transferrina, ferritina y ferroportina, encargados de la entrada, almacenamiento y salida de hierro celular, respectivamente. Esta medición se comparó con la abundancia de los mismos transcritos en los peces alimentados con la dieta control al inicio y al final del desafío, tanto en riñón proximal como en hígado. Los resultados indicaron que tanto en riñón como en hígado hay un de aumento significativo en la abundancia del receptor de transferrina y con una disminución de la abundancia de ferritina y ferroportina en los peces alimentados con DFP. Este comportamiento transcripcional canónico demuestra que a pesar de que los peces logran “activar” su sistema de captura de hierro y “reprimir” su sistema de salida del metal en respuesta al déficit farmacológico, la incorporación continua del quelante a través de la dieta de los peces evita que los peces logren aumentar el contenido intracelular. Esto correlaciona con una limitada disponibilidad de hierro para la replicación bacteriana, altamente requirente de este metal, y una reducida carga bacteriana en los tejidos de peces tratados con elquelante. Este último punto adquiere relevancia, considerando que a pesar que todos los pecesinfectados con las mismas cargas bacterianas iniciales, los peces alimentados con la dieta suplementada con el quelante alcanzaron sólo cargas bacterianas menores al 30% de la carga total observada en peces alimentados con la dieta control al final del desafío.

En conclusión, los resultados muestran que el quelante de hierro DFP es un efectivo protector frente a la infección con Piscirickettsia salmonis y la muerte por SRS. Este quelante es capaz de disminuir la disponibilidad y residencia de hierro en los peces cuando es suministrado a través de la dieta, impactando directamente sobre el contenido del metal en órganos blanco de Piscirickettsia salmonis. Estas observaciones se ven respaldadas por el comportamiento transcripcional de los transcritos que codifican para proteínas marcadoras del estatus celular del metal y por la carga bacteriana reducida en los peces alimentados con el quelante. En su conjunto, estos resultados se presentan como una prometedora estrategia para disminuir el impacto de SRS en la industria salmonera nacional de manera sustentable, mediante el uso de una estrategia farmacológica no antibiótica, enfocada en procesos biológicos claves del hospedero que la bacteria explota para producir la infección.