Vectores y reservorios de P. salmonis

La acuicultura en Chile es una actividad económica de alta relevancia para el país, cuya expansión ha generado importantes ingresos económicos, principalmente en la zona sur-austral. El significativo incremento de la producción acuícola durante las últimas tres décadas, y el cultivo de salmones en particular, ha traído consigo un incremento en la aparición de enfermedades de diversos tipos en los centros de producción. Piscirickettsiosis, la enfermedad causada por la bacteria intracelular Piscirickettsia salmonis, es la enfermedad bacteriana más importante del cultivo de salmónidos en agua de mar en Chile y es considerada una seria amenaza a la sustentabilidad de esta importante industria. Esta bacteria representa la mayor causa de uso de antibióticos a nivel del cultivo industrial de salmónidos, producto de las pocas e inefectivas herramientas profilácticas de control para manejar la patología.

P. salmonis es una bacteria compleja, y a pesar de los importantes avances logrados en el conocimiento del agente durante los últimos años, su epidemiología aún tiene un gran número de factores desconocidos, involucrados en la mantención del agente dentro de las unidades productivas y el medioambiente en general. El desarrollo del presente estudio representa un apoyo a la compleja resolución del problema de controlar esta enfermedad, realizando estudios de los posibles reservorios y vectores involucrados en la mantención y diseminación de la enfermedad.
Este informe presenta los detalles del análisis de las muestras y los resultados de la detección de P. salmonis en diferentes matrices bióticas y abióticas recolectadas en los centros de producción de salmón bajo brotes activos de Piscirickettsiosis. Se realizaron seis campañas de muestreo en la región Austral de Chile (X, XI y XII regiones) con el apoyo del equipo IFOP liderado por el Dr. Sergio Contreras, en el que se recolectaron 36 muestras de agua, 36 muestras de sedimentos, 36 muestras de biopelícula, 94 muestras de peces, 3 muestras de zooplancton y 150 muestras de moluscos, las que posteriormente fueron utilizadas para la cuantificación, aislamiento, cultivo y secuenciamiento completo de P. salmonis. Adicionalmente se utilizaron muestras históricas de P. salmonis de colección de IFOP para el establecimiento de la dinámica poblacional de la bacteria en Chile. Se tomaron 6 muestras de agua de sitios geográficamente alejados de los centros de producción y cultivo de salmón, para ser usadas como controles negativos.

Las bacterias patógenas excretadas por los peces enfermos pueden acumularse en el agua, sedimento y biopelículas. En este estudio, todos los sitios fueron positivos para la presencia de P. salmonis con números que variaron de 10 a 9X 103 células por litro de agua. Además, las muestras de agua recolectadas en tres de los seis centros tenían números de P. salmonis> 200 células L-1. Vale la pena señalar que cuando se compararon los metadatos de los centros con los datos de P.salmonis en el agua, el centro 6 tiene el mayor índice de mortalidad reportado una semana antes y en el momento de la recolección de las muestras de agua. Por lo tanto, el mayor número de bacterias observadas en el agua es probablemente en respuesta a la prevalencia de la enfermedad en el centro y las bacterias desprendidas por peces infectados. De manera similar, el centro 2 tiene una alta mortalidad debido a SRS antes del muestreo y el número observado de P. salmonis en las muestras de agua corresponde a la prevalencia de la enfermedad en el centro.

Considerando que, P. salmonis se detectó constantemente en los sedimentos variando en números de 30 a 300 células por gramo de sedimentos. En este estudio, se detectaron niveles bajos de P. salmonis en las muestras de sedimentos recolectadas de todos los centros muestreados con el número más bajo encontrado en los sedimentos del centro 2. Cuando se compararon los metadatos del centro con los números de P.salmonis en el sedimento es evidente que en el ciclo anterior, dicho centro presentó las mortalidades más bajas debido a SRS, en comparación con otros centros muestreados. Por otro lado, el centro 1, que tenía tasas de mortalidad altas en el ciclo anterior, tenía el mayor número de P.salmonis en los sedimentos. Los resultados apuntan hacia la acumulación de P. salmonis en los sedimentos en respuesta a la prevalencia de la enfermedad. Además, se requiere un trabajo de investigación para determinar la duración de P. salmonis en los sedimentos, ya que los sedimentos pueden ser un reservorio importante de P. salmonis.

En comparación, solo una muestra de biofilm de un sitio (centro 6) tenía un número cuantificable de P. salmonis (200 células por gramo). En el momento del muestreo, este centro tenía el mayor número de mortalidad informada (aproximadamente el 3% de los peces). Es probable que P.salmonis de las jaulas con brote activo de la enfermedad se haya adherido a las biopelículas en las superficies más cercanas a las jaulas enfermas. En las muestras de biopelículas alejadas de las jaulas, no se detectó P.salmonis. Un estudio in vitro realizado por la Universidad de Chile reveló la presencia del complejo de adhesión Piscirickettsial (CAP) en teflón. Al relizar un estudio en campo, introduciendo cuerdas con distintos materiales utilizados en la salmonicultura al interior de una jaula de cultivo de salmones que presentaba mortalidades por SRS, el equipo de la Universidad de Chile encontró la presencia de P. salmonis en pqueños trozos de nylon sometidos a PCR tradicional. Esto sugiere que las biopelículas más cercanas a las jaulas con enfermedades pueden ser reservorios de P. salmonis, pero las biopelículas marinas alejadas de las jaulas tienen un potencial limitado para los reservorios de P. salmonis.

P. salmonis ha sido reportado de las especies de peces nativos de Chile Eleginops maclovinus, Odontesthes regia, Sebastes capensis y Salilota australis. En este estudio, hemos detectado sistemáticamente P. salmonis en las branquias de peces silvestres capturados alrededor de los centros de producción en el momento del muestreo. Se encontró que Eleginops maclovinus y Sebastes capensis portaban P.salmonis. De todos los órganos internos de los peces, solo se encontró un pez salvaje que muestra la presencia de infección por P. salmonis. El papel de la población de peces silvestres en la propagación de P. salmonis sigue sin estar claro y debe investigarse más a fondo.

En este estudio, se recolectaron y analizadron 150 muestras de moluscos alrededor de 5 centros de cultivo de salmón y no detectamos la presencia de P. salmonis en las muestras de tejido. La presencia de P. salmonis en los moluscos no se puede descartar por completo, ya que el tamaño de la muestra para este estudio es relativamente pequeño. Un estudio in vitro realizado por la Universidad de Chile reveló mediante MEB la presencia del complejo de adhesión Piscirickettsial (CAP) y de la bacteria P. salmonis en trozos de conchas de Mytilus chilensis. Al realizar estudios de nfectividad, éstos resultaron positivo. Al relizar un estudio en campo, introduciendo cuerdas con trozos Mytilus chilensis al interior de un centro de cultivo que presentaba mortalidades por SRS, el equipo de la Universidad de Chile detectó la presencia de P. salmonis mediante PCR tradicional. Los resultados sugieren que P. salmonis posee la capacidad de adherirse formando CAP en la superficie de conchas de chorito y que la cercanía a las jaulas que presentan la enfermedad jugaría un rol en la difusión de la enfermedad. Sin embargo, se suguiere realizar investigaciones de campo adicionales, con un mayor número de centros y más moluscos, considerando la incorporación de análisis de viabilidad de la bacteria.

Recolectamos muestras de zooplancton con una red de barridos netos de 73 μm en tres ubicaciones seleccionadas al azar alrededor del centro de cultivo para determinar la presencia de P.salmonis en el zooplancton. Nuestro objetivo fue determinar si el zooplancton podría ser una fuente importante de P. salmionis, nuestros resultados de PCR fueron negativos para todas las muestras analizadas, lo que sugiere que es poco probable que el zooplancton sea un reservorio significativo de P. salmonis.

En el presente proyecto, nuestro objetivo fue comprender la dinámica poblacional de las cepas de Piscirickettsia salmonis que infectan los centros de cultivo de salmón en Chile, así como descifrar la virulencia y la resistencia a los antibióticos que tienen sus genomas. Para esto, seleccionamos 60 cepas de P. salmonis para la secuenciación completa del genoma. Los resultados del trabajo genómico llevado a cabo en el laboratorio del profesor Pierre-Edouard Fournier en la Universidad de Aix-Marsella sugieren la existencia de dos grupos filogenéticamente distantes. En resumen, el pan genoma de P. salmonis consistió en 1480 genes centrales, 2122 genes externos y 2434 genes únicos en la nube específicos para cepas individuales. Los genomas principales se dividen en dos grupos distintos. El aislado bacteriano PC100 fue de particular interés debido a la aparición de un gran número de genes de resistencia a los antibióticos presentó una agrupación de aislados con un conjunto de genes del núcleo diferenciado distintivo.

Para el establecimiento de los mecanismos y vías de difusión de P. salmonis, el grupo de la Universidad de Chile liderado por el Dr. Julio Larenas, realizó la recolección y análisis de muestras del ectoparásito Caligus rogercresseyi, desde un centro de engorda de salmón del Atlántico (Salmo salar) ubicado en la Región de Los Lagos, que presentaba un brote activo de SRS para detectar la presencia de la bacteria al interior del ectoparásito. Se utilizó un tamaño muestral de 50 individiuos por categoría (hembras, machos y chlimus IV), a los cuales se les realizó un análisis de tejido mediante la técnica de inmunohistoquímica. Se determinó que un 42% de las hembras, un 28% de los machos y un 28% de los Chalimus IV presentaron una reacción positiva a la inmunohistoquímica. Un 81,6% de los individuos positivos presentaron la bacteria a nivel de tejido. Esto sugiere que Caligus rogercresseyi desempeña algún papel en la difusión de P. salmonis.

Con el apoyo del Grupo Etecma liderado por el Dr. Marcos Godoy, se realizaron también 8 campañas de muestro en centros de cultivo con brotes activos de SRS e historial de amebiasis branquial en años previos o diagnosticados previamente con Enfermedad Proliferativa Branquial (PGD) para la obtención de peces con signos clínicos de infección concomitante de P. salmonis y P. perurans, su posterior cultivo en laboratorio y estudio de tiempo de sobrevida de P. salmonis en ameba. El aislamiento y cultivo de P. salmonis a partir de las muestras de ameba resultaron negativos en todos los casos. Esto sugiere que la ameba no sería un vector de la enfermedad.